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Sveva Valguarnera
Sveva Valguarnera

Diagnostica del Cancro: Come funziona, Limiti attuali e ADAP

Indice

La tecnica ADAP ha mostrato una sensibilità mille volte maggiore rispetto alle tecniche attualmente utilizzata in campo clinico.

Uno dei temi più importanti nell’ambito della salute pubblica è quello della prevenzione. Riconoscere in tempo una patologia, sia essa di natura infettiva, autoimmune oppure oncologica, può comportare infatti un’enorme differenza nel decorso e nel trattamento della malattia, talvolta facendo la differenza tra la vita e la morte. Per questo motivo negli ultimi anni si sono susseguite moltissime campagne di prevenzione, volte a sensibilizzare i cittadini sull’importanza di controlli periodici. Basti pensare ai pap test per il tumore al collo dell’utero, o alla colonscopia per il cancro al colon.

Affinché l’attività di prevenzione sia efficace, però, è necessario che i metodi diagnostici utilizzati siano abbastanza sensibili da cogliere i segni delle patologie quando esse sono ancora in uno stadio precoce, e dunque più semplici da curare. Ecco dunque perché parlare di diagnostica del cancro.

Diagnostica, Come funziona?

In linea generale, la diagnosi di laboratorio di una malattia consiste nell’evidenziare, all’interno di un campione proveniente dal paziente, una o più sostanze che identifichino la malattia; in particolare, i metodi diagnostici si possono dividere in due categorie: metodi di diagnosi diretta e metodi di diagnosi indiretta.

I metodi di diagnosi diretta sono quelli volti a rilevare la presenza nel campione di un antigene, cioè di una particolare sostanza peculiare della patologia; sebbene siano utilizzati principalmente nella diagnosi di malattie infettive, come la malaria o la tubercolosi, possono rivelarsi utili anche nella diagnosi di altre patologie che causino la presenza nel siero di determinati antigeni, come ad esempio alcuni tumori.

I metodi di diagnosi indiretta sono invece volti a rilevare l’eventuale risposta immunitaria operata dall’ospite, che può essere causata non solo da un microrganismo ma anche da patologie autoimmuni e oncologiche; ad esempio, sia il diabete di tipo 1 che il cancro alla tiroide presentano dei particolari marcatori immunologici.

Metodi di diagnosi diretta

I metodi di diagnosi diretta più importanti sono le osservazioni al microscopio – ottico, elettronico oppure a fluorescenza – e le indagini colturali; queste ultime consistono nella collocazione del campione all’interno di un terreno le cui caratteristiche fisico-chimiche permettano al microrganismo di moltiplicarsi, rendendone così più semplice l’individuazione. Si tratta però di metodi che hanno dei considerevoli difetti: le osservazioni al microscopio sono poco specifiche e i risultati dipendono moltissimo dalla perizia dell’operatore, mentre le indagini colturali sono spesso molto lente, dal momento che molti microrganismi impiegano diversi giorni per moltiplicarsi a sufficienza.

Metodi di diagnosi indiretta

I metodi di diagnosi indiretta ricercano l’eventuale risposta immunologica di un paziente in risposta alla malattia; sono, ad oggi, i metodi più sicuri e attendibili e quelli più largamente utilizzati, anche perché permettono di diagnosticare non solo malattie infettive ma anche di altra natura, come le malattie autoimmuni e i tumori. Esistono moltissimi metodi di diagnosi indiretta, ma tutti si basano sullo stesso principio: la ricerca all’interno del liquido biologico di anticorpi, come ad esempio le immunoglobuline. Dal momento che le immunoglobuline sono specifiche per un tipo di antigene, questi metodi di diagnosi permettono di risalire con precisione all’antigene che ha provocato la reazione immunitaria.

PCR – reazione a catena della polimerasi

La PCR è una tecnica nata per ovviare alla lentezza delle indagini colturali. Si tratta di una tecnica che consiste nella moltiplicazione di una certa sequenza di acido nucleico – RNA o DNA – che si trova nell’antigene che si vuole ricercare. In particolare, nel caso di malattie autoimmuni, genetiche od oncologiche, vengono amplificate sequenze appartenenti al gene che causa la patologia. Nel caso di malattie infettive vengono amplificate sequenze appartenenti all’agente infettivo, ad esempio un virus e un batterio.

Per potere utilizzare questa tecnica è necessario conoscere la sequenza di DNA o di RNA da amplificare, in modo da potere creare un primer di DNA che sia in grado di fare da stampo per la riproduzione dell’acido nucleico. Il vantaggio della PCR sta nel fatto che a ogni ciclo il primer permette ai frammenti di DNA o RNA presenti nel campione – che vengono detti ampliconi – di duplicarsi, raddoppiandone così la concentrazione.

Dosando in modo opportuno il primer è possibile amplificare in poche ore la sequenza nucleotidica desiderata, permettendo così di procedere con ulteriori indagini. Esiste inoltre una variante del metodo, detta PCR in tempo reale o rqt-PCR, che riesce ad amplificare e simultaneamente quantificare il DNA, risalendo quindi alla concentrazione presente nel campione di partenza.

ELISA – un saggio immunologico

Un altro metodo molto utilizzato in ambito diagnostico è l’ELISA, un saggio immunologico che consiste nel rilevare una sostanza mediante l’uso di anticorpi specifici, ai quali vengono legati degli enzimi. La sostanza da rilevare – ad esempio un antigene – si lega all’anticorpo, il quale grazie alla presenza dell’enzima sviluppa un determinato colore o una fluorescenza che indicano la presenza e la concentrazione dell’antigene.

Diagnostica del Cancro, limiti attuali

Sebbene i metodi attualmente in uso per la diagnostica del cancro siano economici ed efficaci, spesso non hanno la sensibilità sufficiente per rilevare la presenza di una patologia allo stato iniziale, ponendo così a rischio la sopravvivenza del paziente e peggiorandone la prognosi. Nel caso dei saggi immunologici come l’ELISA, ad esempio, si possono avere risultati falsati dovuti alla denaturazione degli antigeni oppure alla presenza di antigeni con epitopi conformazionali. Si tratta di antigeni i cui siti di legame con l’anticorpo sono strutture tridimensionali, formate da molecole che risultano vicine soltanto per effetto del ripiegamento che subisce la struttura dell’antigene.

Quando gli antigeni vengono disposti su un supporto solido, come il gel di agar-agar utilizzato nel saggio ELISA, gli epitopi conformazionali subiscono delle deformazioni che impediscono agli anticorpi di legarli correttamente, falsando il risultato del saggio. Alcuni esempi di anticorpi i cui antigeni presentano epitopi conformazionali sono quelli anti-insulina dei pazienti che soffrono di diabete di tipo 1, e gli anticorpi anti-tiroglobulina che sono presenti nel siero di pazienti affetti da cancro alla tiroide.

Attualmente, gli unici metodi attendibili per la rilevazione di questo tipo di anticorpi sono i saggi radioimmunologici, i quali hanno però diversi lati negativi. Innanzitutto, si tratta di test molto specialistici, che pochi laboratori hanno la possibilità di effettuare. Inoltre, fanno uso di sostanze radioattive, rendendoli quindi potenzialmente pericolosi per gli operatori e portando a problematiche relative allo smaltimento delle storie.

Nuova Diagnostica del Cancro: l’Agglutinazione-PCR (ADAP)

Per ovviare a queste problematiche di diagnostica del cancro, un gruppo di ricerca americano ha recentemente ideato un metodo alternativo che possa permettere di rilevare con maggiore precisione gli anticorpi i cui antigeni presentano epitopi conformazionali, usando una tecnica chiamata agglutinazione-PCR (ADAP).

L’agglutinazione-PCR passo passo

  • Per prima cosa vengono creati dei complessi antigene-DNA, formati da un antigene da una sequenza oligonucleotidica; vengono creati due tipi di complessi che differiscono per la sequenza legata. Si tratta, fondamentalmente, delle due metà di un amplicone, ovvero di una sequenza che può essere amplificata via PCR.
  • I complessi antigene-DNA vengono incubati con il campione di anticorpi.
  • Gli anticorpi agglutinano i complessi antigene-DNA, formando un complesso più grande e permettendo alle due sequenze oligonucleotidiche di legarsi tramite un oligonucleotide “ponte” (vedi figura).
  • Si genera così un amplicone, che potrà essere legato da un primer e amplificato mediante PCR in tempo reale.

L’innovazione di questa tecnica consiste nel fatto che unisce i vantaggi delle tecniche immunologiche – che prevedono il legame di antigeni e anticorpi – con quelli della PCR, che permette di ottenere risultati anche da campioni con concentrazioni piccolissime di materiale genetico. In questo modo, dunque, è possibile ottenere un risultato positivo anche quando la concentrazione degli anticorpi è molto bassa, perché i pochi anticorpi presenti nel campione saranno comunque legati a un numero sufficiente di complessi antigene-DNA per far partire la PCR.

I risultati

Stando ai risultati degli esperimenti condotti fino ad ora, la tecnica ADAP ha mostrato una sensibilità mille volte maggiore rispetto alle tecniche attualmente utilizzata in campo clinico, riuscendo a rilevare la presenza di anticorpi in campioni con concentrazioni molto minori rispetto a quelle determinabili con i saggi radioimmunologici, fino a 3-4 ordini di grandezza più piccole; si tratta inoltre di una metodica relativamente semplice e alla portata di tutti i laboratori che effettuano PCR in tempo reale, permettendo dunque ai medici di ottenere risultati in tempi più brevi.

A differenza di altri metodi, inoltre, l’ADAP consente di rilevare contemporaneamente più tiplogie di anticorpi, aprendo così la strada a nuove possibilità cliniche.

Un altro vantaggio di questa tecnica è la piccola quantità di siero richiesta per il saggio: si ha così un vantaggio per il paziente, particolarmente importante nel caso in cui si debba sottoporre a controlli ripetuti. Sono inoltre allo studio variazioni di questo metodo che possano consentire di rilevare la presenza di anticorpi anche nella saliva, rendendo così il test ancora più semplice ed accessibile a un numero più grande di pazienti. Ad esempio, il test sulla saliva permetterebbe di effettuare campagne di prevenzione su larga scala contro malattie come l’AIDS, permettendo di iniziare il trattamento con farmaci antiretrovirali il prima possibile.

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